Elektrophoretische Verfahren
Die Elektrophorese gehört zu den
elektrochemischen
Analysemethoden. Sie ist ein analytisches
Trennverfahren, das auf der Wanderung geladener Teilchen (Migration)
in einer Elektrolytlösung unter Einwirkung eines elektrischen Feldes
beruht. Die geladenen Teilchen können in gelöster oder in disperser
Form vorliegen.
Durch den unterschiedlichen Aufbau der Teilchen, deren Ladung, Größe
und Solvatation, ist die Kraftwirkung des elektrischen Feldes verschieden.
Die Beweglichkeit bzw. Wanderungsgeschwindigkeit der Teilchen hängen
daher hauptsächlich von ihrer Ladung, der auf sie einwirkenden Feldstärke
und der Viskosität des Elektrolyten ab. Je höher die Ladung
und je kleiner ein Teilchen ist, desto größer ist die Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld.
Das Haupteinsatzgebiet dieser Methode ist die Biochemie zur Trennung und Charakterisierung von Aminosäuren, Peptiden und anderen Biomolekülen.
Prinzip der Trägerelektrophorese
Aufgrund ihrer unterschiedlichen Beweglichkeiten lassen sich in Lösungen
ionisch vorliegende bzw. ionisierbare Stoffe trennen. In der Praxis nutzt
man dazu bevorzugt das Prinzip der Trägerelektrophorese.
Das Trägermaterial z. B. Papier, Celluloseacetat oder ein gelartiges
Material wird mit einer Pufferlösung getränkt und zwischen zwei
Elektroden gebracht. Die Analyselösung wird an einer Startlinie aufgetragen
und eine Gleichspannung
im Bereich von 100 V und mehr angelegt, sodass die Ionen in der Lösung mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
zur entgegengesetzt geladenen Elektrode wandern. Nach Auftrennung des
Gemisches kann man auf dem Trägermaterial die einzelnen Komponenten
des Stoffgemisches mithilfe geeigneter Reagenzien sichtbar machen (Bild 1). Aus diesem Elektropherogramm
kann man die Anzahl der Komponenten und nach vorheriger Kalibrierung auch
ihre Art bestimmen.
Gele als Trägermaterial
Als Trägermaterialien
werden heute hauptsächlich gelartige Stoffe, z. B. Polyacrylamidgele
oder Stärkegele eingesetzt. Deshalb spricht man auch von Gelelektrophorese.
Gele haben eine sehr hohe Viskosität,
sodass sich hier die Größe und Gestalt der zu trennenden Teilchen
viel stärker auswirkt als bei der klassischen Trägerelektrophorese.
Das Stoffgemisch, z. B. Proteine werden direkt auf das Gel aufgetragen.
Nach Anlegen der Spannung wirkt das Gel wie ein molekulares Sieb, das
die größeren Moleküle bzw. Ionen zurückhält
und die kleineren passieren lässt (Bild 2). Auf diese Weise erfolgt
die Trennung chemisch sehr ähnlicher Substanzen anhand ihrer Größe,
also letztlich nach ihrer molaren Masse. Die Maschenweite des "molekularen
Siebes" kann man durch die Änderung der Konzentration des Polyacrylamids
variieren.
Mit einem 30 %igen Gel trennt man Peptide mit bis zu 100 Aminosäureresten,
mit einem 10 %igen Gel dagegen Proteine, die aus bis zu 1000 Aminosäureresten
aufgebaut sind.
Unter den gleichen Analysebedingungen erhält man von einer bestimmten
Probe immer wieder das gleiche charakteristische Elektropherogramm, einen
"Fingerabdruck" der Probe (Bild 3).
So beruht der in der Kriminaltechnik durchgeführte "genetische
Fingerabdruck" zur Überführung
von Straftätern auf der gelektrophoretischen Trennung von Nucleinsäuren.
Für die DNA-Analyse,
Identitäts- und Reinheitsprüfungen von Arzneistoffen sowie umweltanalytische
und medizinische Anwendungen ist die trägergebundene Elektrophorese
von großer Bedeutung.
Anwendungen
Besonders geeignet sind elektrophoretische Verfahren zur Trennung von
Aminosäure- und Eiweißgemischen. Aminosäuren haben in
wässrigen Lösungen eine zwitterionische Struktur. In Abhängigkeit
von ihrem isoelektrischen Punkt liegen sie bei niedrigen pH-Werten 
hauptsächlich in kationischer und bei höheren pH-Werten 
hauptsächlich in anionischer Form vor.
Nach dem Prinzip der isoelektrischen Fokussierung kann so eine sehr scharfe Trennung der Komponenten erzielt werden. Dazu wird zwischen Anode und Katode zusätzlich ein pH-Gradient gelegt. Die Komponenten wandern dann nur bis zu der Stelle, wo der pH-Wert im Gradientenfeld dem isoelektrischen Punkt entspricht.
Die Kapillarelektrophorese ist eine Weiterentwicklung der klassischen Trägerelektrophorese. Hier erfolgt die Trennung von kleinsten Substanzmengen in einer dünnen Quarzglaskapillare. Das hochmoderne Verfahren kann computergestützt und vollautomatisch durchgeführt werden. Die Kapillarelektrophorese wird auch zur Trennung anorganischer Ionen eingesetzt.